第六章 蛋白轉(zhuǎn)膜

                                第六章 蛋白轉(zhuǎn)膜

6.1  轉(zhuǎn)膜的定義

將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如 NC 膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理*相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。

6.2  轉(zhuǎn)移膜的選擇

    雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于 Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC） 和PVDF 膜。NC 膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的 NC 膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 兩種規(guī)格的 NC 膜。大于 20 kD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜，小于 20 kD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜了，如用 0.45 μm 的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough"的現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。

zui 常 用 于 Western Blot 的轉(zhuǎn)移膜主要是 硝 酸 纖 維 素 （ Nitrocellulose, NC ）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交。

    硝酸纖維素（nitrocellulose, NC）膜：NC 與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無(wú)需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在 NC 上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失； NC韌性較差，易損壞。

    聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。

膜的選擇主要根據(jù)：

膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大小）；

不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；

如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。



                                                      

6.3  轉(zhuǎn)膜步驟（以槽式濕轉(zhuǎn)為例）

1.  將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10 min。

注意：如檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。

2.  依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙 6 片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10 min。如用 PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5秒鐘。

3.  裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。

    切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。

4.  將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100 V，1 h（電流約為 0.3 A）。

注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。


 5.  轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。

                                                                        

6.4  轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)

1. 泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移 buffer 浸泡 20min；

a. 凝膠若是沒(méi)在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜 buffer 中浸泡，就會(huì)在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。

b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

2. 轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽(yáng)極碳板；

3. 轉(zhuǎn)膜條件：0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻）；

（具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，反之則短。）

4. 其它注意事項(xiàng)：

a. 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn)膜效率并會(huì)使膜臟掉。

b. 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不*。

c. 保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過(guò)大和過(guò)小都會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效率。

                      d. 雞來(lái)源的抗體與 PVDF 和尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故如果選擇雞來(lái)源的抗體

6.5  轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）

   轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的 TBST（或 PBST）中漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的 1-2 條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液或硬度墨汁染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的 SDS-PAGE 膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

a. 麗春紅染色：蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。

b. 印度墨汁染色：只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記 A 蛋白探針的 Western 印跡過(guò)程。

印度墨汁不能和化學(xué)發(fā)光物合用，若是使用呈色反應(yīng)的酶檢測(cè)法時(shí)，印度墨汁的黑色會(huì)使凝膠難于拍照。這時(shí)，可改用其他檢測(cè)方法或換用麗春紅 S。

注意：從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。